化妝品中補(bǔ)骨脂特征成分補(bǔ)骨脂素、異補(bǔ)骨脂素、新補(bǔ)骨脂異黃酮和補(bǔ)骨脂二氫黃酮的檢測方法
1 適用范圍
本方法規(guī)定了用高效液相色譜法定性檢測化妝品中補(bǔ)骨脂特征成分補(bǔ)骨脂素、異補(bǔ)骨脂素、新補(bǔ)骨脂異黃酮和補(bǔ)骨脂二氫黃酮的方法。
本方法適用于化妝品中補(bǔ)骨脂特征成分補(bǔ)骨脂素、異補(bǔ)骨脂素、新補(bǔ)骨脂異黃酮和補(bǔ)骨脂二氫黃酮的定性測定。
2 方法提要
樣品在經(jīng)過提取后，經(jīng)高效液相色譜儀分離，二極管陣列檢測器檢測，經(jīng)與平行操作的補(bǔ)骨脂素、異補(bǔ)骨脂素、新補(bǔ)骨脂異黃酮和補(bǔ)骨脂二氫黃酮對照品及補(bǔ)骨脂對照藥材比較，以保留時間和紫外光譜圖定性，鑒別補(bǔ)骨脂特征成分補(bǔ)骨脂素、異補(bǔ)骨脂素、新補(bǔ)骨脂異黃酮和補(bǔ)骨脂二氫黃酮的存在。本方法對補(bǔ)骨脂素、異補(bǔ)骨脂素、新補(bǔ)骨脂異黃酮和補(bǔ)骨脂二氫黃酮的檢出限和取樣品0.5 g時的檢出濃度見表1。
表1 4種補(bǔ)骨脂特征成分的檢出限和檢出濃度
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化合物
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檢出限（ng）
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檢出濃度（μg/g）
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補(bǔ)骨脂素
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0.3
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0.6
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異補(bǔ)骨脂素
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0.3
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0.6
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新補(bǔ)骨脂異黃酮
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0.3
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0.6
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補(bǔ)骨脂二氫黃酮
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0.3
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0.6
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3 試劑和材料
除另有規(guī)定外，所用試劑均為分析純，水為實驗室用一級水。
3.1 乙腈，色譜純。
3.2 補(bǔ)骨脂素，純度≥99%。
3.3 異補(bǔ)骨脂素，純度≥99%。
3.4 新補(bǔ)骨脂異黃酮，純度≥98%。
3.5 補(bǔ)骨脂二氫黃酮，純度≥99%。
3.6 補(bǔ)骨脂，中國食品藥品檢定研究院，供鑒別用。
3.7 補(bǔ)骨脂特征性成分混合標(biāo)準(zhǔn)溶液（=0.1 μg/mL）：分別稱取補(bǔ)骨脂素（3.2）、異補(bǔ)骨脂素（3.3）、新補(bǔ)骨脂異黃酮（3.4）、補(bǔ)骨脂二氫黃酮（3.5）對照品各5 mg（精確到0.1 mg），置500 mL量瓶中，用甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，配制成質(zhì)量濃度各為10 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液。精密量取各標(biāo)準(zhǔn)溶液0.1 mL置10 mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得0.1 μg/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液。
3.8 補(bǔ)骨脂標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液：取補(bǔ)骨脂對照藥材0.2 g，置50 mL三角瓶中，加30 mL 70%乙醇回流提取1h，濾過，濾液置100 mL量瓶中，加70%乙醇稀釋至刻度，搖勻，即得。
4 儀器
4.1 高效液相色譜儀：具二極管陣列檢測器。
4.2 分析天平：感量為0.1 mg。
4.3 移液器。
4.4 渦旋振蕩器。
4.5 超聲波清洗儀（功率不低于200W）。
4.6 高速離心機(jī)：轉(zhuǎn)速不小于10000 r/min。
5 測定步驟
5.1 樣品預(yù)處理
膏、霜、乳類：稱取0.5 g（精確至0.1 mg）樣品，置10 mL量瓶中，加6 mL甲醇，渦旋振蕩使試樣與提取溶劑充分混勻，超聲提取20 min，放至室溫，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，轉(zhuǎn)移至10 mL具塞塑料離心管中，以12000 r/min離心5 min，上清液經(jīng)0.45 μm濾膜過濾，濾液作為待測溶液備用。
液體類：稱取0.5 g（精確至0.1 mg）樣品，置10 mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，混勻，必要時，轉(zhuǎn)移至10 mL具塞塑料離心管中，以12000 r/min離心5 min，上清液經(jīng)0.45 μm濾膜過濾，濾液作為待測溶液備用。
固體粉類：稱取0.5 g（精確至0.1 mg）樣品，置10 mL量瓶中，加8 mL甲醇，混勻，超聲提取20 min，放至室溫，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，靜置，必要時，轉(zhuǎn)移至10 mL具塞塑料離心管中，以12000 r/min離心5 min，上清液經(jīng)0.45 μm濾膜過濾，濾液作為待測溶液備用。
5.2 高效液相色譜參考條件
色譜柱：C18柱（100 mm×4.6 mm，3 μm，以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑）或具有同等柱效的色譜柱；
流動相：乙腈＋0.1%醋酸水溶液，梯度洗脫，洗脫程序見表1。
注：梯度洗脫條件，操作者可根據(jù)樣品的不同選擇最佳條件，使4種成分與其他組分峰獲得完全分離。
流速：1.0 mL/min。
檢測波長：246 nm。
柱溫：30℃。
進(jìn)樣量：10 ?0?8L。
5.3 樣品測定
按設(shè)定的色譜條件（5.2），取補(bǔ)骨脂特征性成分混合標(biāo)準(zhǔn)溶液（3.7）進(jìn)樣，進(jìn)行高效液相色譜分析，記錄各色譜峰相應(yīng)的保留時間和紫外光譜圖；取補(bǔ)骨脂標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液（3.8）進(jìn)行高效液相色譜分析，記錄各色譜峰相應(yīng)的保留時間和紫外光譜圖。取待測溶液（5.1）進(jìn)樣10 μL分析，若樣品色譜圖中，在與補(bǔ)骨脂特征性成分--補(bǔ)骨脂素、異補(bǔ)骨脂素、新補(bǔ)骨脂異黃酮和補(bǔ)骨脂二氫黃酮對照品相應(yīng)保留時間處有相同色譜峰出現(xiàn)，且具有相同的紫外光譜，則可以定性鑒別補(bǔ)骨脂特征性成分補(bǔ)骨脂素、異補(bǔ)骨脂素、新補(bǔ)骨脂異黃酮和補(bǔ)骨脂二氫黃酮的存在。
5.4 平行試驗
按以上步驟操作，對同一樣品獨(dú)立進(jìn)行測定，獲得的兩次獨(dú)立測試的色譜峰保留時間不得超過±1 min。
5.5 陽性結(jié)果確證
測定過程中若補(bǔ)骨脂素和異補(bǔ)骨脂素檢出陽性結(jié)果，而新補(bǔ)骨脂異黃酮和補(bǔ)骨脂二氫黃酮低于檢出限，可適當(dāng)富集樣品對新補(bǔ)骨脂異黃酮和補(bǔ)骨脂二氫黃酮的檢測進(jìn)一步確證。
6 精密度、穩(wěn)定性和重復(fù)性
高、低兩個濃度水平的補(bǔ)骨脂標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液的精密度、穩(wěn)定性和重復(fù)性，在不同空白基質(zhì)中，補(bǔ)骨脂素和異補(bǔ)骨脂素、新補(bǔ)骨脂異黃酮和補(bǔ)骨脂二氫黃酮4種特征性成分的保留時間和峰面積的RSD均小于5%（n=6）。
7 色譜圖
圖1 4種補(bǔ)骨脂特征成分混合標(biāo)準(zhǔn)溶液（10 μg/ mL）HPLC色譜圖
圖2 補(bǔ)骨脂標(biāo)準(zhǔn)溶液（2 mg/mL）HPLC色譜圖
色譜峰：1. 補(bǔ)骨脂素，2. 異補(bǔ)骨脂素，3. 新補(bǔ)骨脂異黃酮，4. 補(bǔ)骨脂二氫黃酮
